Desktop Tower Defense spelas på en karta som liknar ett kontorsskrivbord. Spelaren måste stoppa ett bestämt antal fiender, kända inom genren som ”creeps”, från att nå en bestämd punkt på spelplanen. Detta uppnås genom att bygga och uppgradera torn som skjuter på, skadar och dödar fiendens creeps innan de hinner nå sitt mål. Till skillnad från många andra tower defense-spel är vägen för själva creepsen inte fastställd; istället bestämmer de byggda tornen creepsens väg, som tar den kortaste vägen de kan hitta till utgången. Spelet tillåter inte spelaren att göra en utgång helt otillgänglig, men nyckelstrategier kretsar kring att leda creeps in i långa, slingrande korridorer.